Título: Bacteriología
de la laguna del Parque Sarmiento
Autoras: Bosque Analía, Aguada Mariana,
Luján Belén, Moya Antonella y Asaduroglu Julieta
Asignatura: Proyecto
de investigación
Sexto año del Nivel
Medio del Ciclo de Especialización en Ciencias Naturales
Av. Revolución de
Mayo 1476; Bº Crisol; 5014 Córdoba; Argentina
Director del
proyecto: Prof. Federico Kopta
Jefe de Trabajos
Prácticos del Laboratorio de Ciencias Naturales: Exequiel Di Tofino
Profesora de
Microbiología y Salud: Beatriz Lázaro
Año: 2008
Abstract
This
work contains the research work conducted in
The
most important results show that:
-
In the cultivation of total coliform, the point that juvenile colony-forming
units per milliliter won, was a point of sampling 1 (SE lagoon) with 54 cfu/ml,
while the largest number that corresponded to the point of sampling 6 (N
lagoon), with 450 cfu/ml.
-
In the cultivation of Escherichia coli,
the smallest spread was at the point 2 (S lagoon), with 3 cfu/ml and the
maximum value, was presented at the point 6 with 100 cfu/ml. In all cases,
exceeding the 1.26 cfu / ml (126 colonies per 100 ml) named in the interim
version of the guide levels of water quality environment for direct contact
with human recreation for Escherichia
coli.
From
these results it can be inferred that the presence of fecal contamination is
recent and positive results with concern because of the high value they threw
it, checking our assumptions and leading to look for possible causes to solve
this problem.
Resumen
Este trabajo contiene el trabajo de investigación realizado
en el año 2008, en relación con la bacteriología de la laguna del Parque
Sarmiento.
Los resultados obtenidos más importantes muestran que:
- En el cultivo de coliformes totales, el punto que
menores unidades formadoras de colonias por mililitro obtuvo, fue el punto uno de muestreo (SE Laguna) con 54
ufc/ml, mientras que el que mayor número correspondió al punto seis de muestreo
(N Laguna) con 450 ufc/ml. En todos los
casos, supera las 50 ufc/ml (5.000 colonias cada 100 ml) mencionadas por DIPAS.
-En el cultivo de Escherichia coli, la menor proliferación fue en el punto dos, con 3
ufc/ml (S laguna sobre desagüe calle Paunero) y el máximo valor se presentó también
en el punto seis, con 100 ufc/ml. En
todos los casos, supera las 1,26 ufc/ml (126 colonias cada 100 ml) citadas en
la versión interina de los Niveles guía de calidad de agua ambiente para
recreación humana con contacto directo correspondientes a Escherichia coli (Recursos
Hídricos de
De estos resultados se puede inferir que la
presencia de contaminación fecal reciente es positiva y con resultados
preocupantes debido al alto valor que arrojaron, comprobando nuestra hipótesis
y conllevando a buscar las posibles causas, para solucionar dicho problema.
Introducción
El presente trabajo
contiene el plan de trabajo a realizar
durante todo el ciclo lectivo del año 2008, en relación con la bacteriología de
la laguna del Parque Sarmiento.
A continuación se
hará una síntesis de factores fundamentales para dicha investigación.
“Al hacer el análisis de las aguas no buscamos tal o
cual organismo patógeno, es decir, no aislamos o identificamos los
microorganismos patógenos del agua, sino que averiguamos si esta contiene o no
contaminación de origen fecal.
Los microorganismos existentes pueden
proceder de la propia agua, del aire y la tierra, o de las heces.
Un recuento total elevado puede ser
síntoma de contaminación por bacterias extrañas al ecosistema, por el
contrario, un conteo total bajo es un buen índice de la situación del agua
objeto de estudio.
La reglamentación española marca como valor
orientativo de calidad no más de 10 bacterias/ mililitro de agua, y como valor
máximo tolerable 200 bacterias/ml de agua. A consecuencia, si nos sale un valor
mayor a 200 bacterias/ml de agua indica que el agua no es potable y
podríamos recomendar una desinfección con cloro o lejía.” (Di Tofino, 2008)
“A su vez, existen factores que inciden en
la flora microbiana los cuales deben ser tenidos en cuenta:
·
La
acidez disminuye el contenido de microorganismos.
·
La
materia orgánica lo aumenta.
·
Mucho
oxigeno disuelto disminuye los microorganismos anaerobios.
·
Las
sales, si son abundantes, producen que el agua sea casi estéril.
·
Si
existe poca cantidad de sales se estimula al desarrollo bacteriano.
·
El
almacenamiento y la filtración disminuyen el número de microorganismos.
·
La
temperatura puede aumentar o disminuir el contenido bacteriano.
·
La
turbidez hace que el contenido bacteriano pueda aumentar, ya que los rayos UV
no manifiestan su acción.
·
Lo
protozoos fagocitan bacterias y así disminuyen el numero de estas.
En
función a la temperatura como parámetro y de acuerdo a la temperatura
registrada durante las mediciones realizadas en la laguna, el cual arrojó un
valor de 15º C aproximadamente, esta la clasificación del tipo de
microorganismos que esperamos encontrar en dicho medio es la de mesófilos, los cuales presentan un
crecimiento óptimo en rangos de temperatura moderada. En general son
microorganismos que se encuentran en animales de sangre caliente y en medios
acuáticos y terrestres de latitudes tropicales.
Los organismos mesófilos tienen un
valor limitado como indicador de la presencia de patógenos o sus toxinas, un
recuento total de aerobios mesófilos bajos, no aseguran que un agua este exenta
de patógenos o sus toxinas, pero tampoco un recuento total alto significa,
inevitablemente presencia de flora patógena.
En función al pH registrado en la
laguna el cual es de aproximadamente 7,5 los organismos que encontraremos serán
organismos neutrófilos:
microorganismos cuyo pH de crecimiento, es alrededor de 6-8.
Microorganismos supuestos de la laguna.
COLIFORMES TOTALES
Son bacilos Gram negativos, aerobios y
anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo coniformes forman parte
varios géneros: Escherichia
Enterobacter
Klebsiella
Citrobacter
Aunque su especificidad como indicador no
es buena, se suelen usar como índices de contaminación fecal. Los coliformes
son un indicador muy útil para determinar la posible presencia de virus y
bacterias patógenas entéricas en las
aguas. El agua que no contiene coniformes totales se considera libre de
bacterias productoras de enfermedades.” (Di
Tofino 2008).
“
COLIFORMES FECALES
La determinación la terminación de
coliformes fecales en agua, en agua, es un análisis de contaminación fecal más
reciente que la determinación de coliformes totales; por eso los coniformes
fecales son el microorganismo patrón utilizado por muchos laboratorios.
Consideramos coliformes fecales a: Escherichia
Citrobacter
Klebsiella
Se realiza la incubación a 44,5 º C (más
menos 0,2º C)
·
Las bacterias coniformes producen enfermedades entéricas.
·
Escherichia coli produce dolor abdominal,
diarrea, nauseas, vómitos, y fiebre. Una cepa de esta especie es responsable
del Síndrome Urémico Hemolítico.
·
Klebsiella produce enfermedades
respiratorias.
·
Citrobacter produce alteraciones a nivel
del colon y a nivel intestinal.
Riesgos en la salud y el ambiente
derivados del desborde de líquidos cloacales en las calles de Córdoba (válido
para la contaminación de estos líquidos en la laguna del Parque Sarmiento)
“La presencia y circulación de
líquidos cloacales crudos (sin tratamiento) a cielo abierto, pueden traer
consecuencias de diferente tipo y gravedad, tanto para las personas que residen
en las inmediaciones como para transeúntes frecuentes u ocasionales, entre las
que pueden mencionarse:
Para la salud:
· Las aguas cloacales sin
tratamiento son portadoras de bacterias entéricas, como por ejemplo Escherichia coli (que precisamente es
utilizada como un indicador de contaminación fecal de aguas). Si bien la
mayoría de las cepas de esta bacteria son inocuas y viven en los intestinos de
los seres humanos y animales saludables, existe una cepa (llamada O157:H7) que
produce una potente toxina que es responsable de severas diarreas y del
síndrome urémico hemolítico, que puede afectar seriamente a los niños pequeños y
a los ancianos.
· Además de esta bacteria, suelen
estar presentes otras altamente peligrosas para la salud (por ejemplo especies
de los Géneros Salmonella, Shigella,
Leptospira, Campylobacter jejuni y
el Vibrio cholerae). Todas estas
generan trastornos que van desde fiebre, debilidad, nauseas, retortijones,
vómitos y calambres, hasta enfermedades entéricas y pulmonares graves (por
ejemplo: diarreas, shigelosis, fiebre tifoidea, leptospirosis y cólera).
· Estas aguas negras pueden servir
a la transmisión de diversos virus (Adenovirus, Rotavirus, Enterovirus, Virus
Norwalk), por ejemplo agentes causales de afecciones intestinales y el
responsable de la poliomielitis y el de la hepatitis A.
· Pueden encontrase asimismo hongos
microscópicos, como por ejemplo Aspergillus.
Cerca de veinte especies de este hongo son causantes de un grupo de
enfermedades (denominadas aspergillosis) que afectan a los seres humanos y
animales (peces, mamíferos, aves e insectos). Estas dolencias van desde cuadros
de tipo alérgico (broncopulmonares y sinusitis), hasta infecciones
generalizadas que ponen en riesgo la vida de las personas que sufren
alteraciones del sistema inmunológico. Algunas especies de este hongo pueden
contaminar granos y raciones almacenados,
produciendo varios tipos de
toxinas, cuya ingestión puede inducir efectos letales o cancerígenos,
particularmente en animales.
· También en las aguas cloacales
pueden hallarse diversos parásitos intestinales, como protozoarios (ej.: Entamoeba, Cryptosporidium parvum, Balantidium coli y Giardia
lamblia), gusanos helmintos como nemátodos (Ascaris lumbricoides), Ancylostoma,
Trichuris y huevos de tenias.
· La ruta primaria de exposición a
los múltiples organismos presentes en aguas negras, es el contacto mano-boca o
la “ruta fecal-oral”, la cual puede ocurrir durante ingestión de alimentos o
agua (contaminadas directamente por salpicadura, manipulación sin observar
higiene adecuada de manos o utensilios, o indirectamente por agentes vectores,
como por ejemplo las moscas), al fumar, o al tocarse el rostro con las manos o
guantes contaminados. La inhalación de aerosoles conteniendo microorganismos es
menos común, pero puede ser una vía importante de ingreso de estos organismos
en determinadas situaciones. En el caso particular que tratamos aquí, el
tránsito vehicular genera aerosoles y abundantes salpicaduras, que llegan
directamente a las personas, animales, ropas, etc. y que además pueden
transportarse por acción del viento hasta una distancia considerable. Si bien
la absorción de éstos microorganismos a través de la piel es poco probable,
puede darse cuando ésta se encuentra dañada previamente (sea por cortes,
raspones, pinchazos, quemaduras o herida de otro tipo). Las membranas mucosas
(en nariz y ojos) también proveen una vía de entrada más a los organismos
patógenos.
· Finalmente, en esta agua suelen
existir otros elementos contaminantes como por ejemplo hidrocarburos como el
diclorobenceno (provenientes de las pastillas desodorantes de inodoros) y
alquil-benceno (provenientes de los detergentes biodegradables), y
eventualmente hasta desechos origen industrial, cuya presencia y concentración
varían considerablemente, de acuerdo a la época del año y a la existencia o no
de conexiones clandestinas a la red cloacal.
Para el ambiente:
· Muchos de los agentes etiológicos
antes mencionados pueden afectar no solamente la salud humana, sino también la
de animales domésticos y silvestres.
· Las aguas servidas que circulan
por las calles pueden llegar hasta algún curso de agua (en nuestro caso el río
Suquía). De esta forma aportan, por un lado, los agentes infecciosos ya
mencionados que contaminan el agua volviéndola no apta para el consumo y el
baño, y por el otro, llevan cantidades importantes de materia orgánica, fósforo
y nitrógeno, que a su vez producen eutrofización (crecimiento desmedido de
algas, diatomeas y plantas acuáticas) en zonas en que el agua tiene circulación
lenta. Este proceso, a su vez, desencadena el crecimiento acelerado de
bacterias aeróbicas que utilizan cantidades crecientes de Oxígeno para degradar
la materia orgánica presente. Como consecuencia de ello, decrece la
concentración de oxígeno disuelto en el agua y se produce la mortalidad de las
especies de la fauna acuática que son menos tolerantes a bajos niveles de este elemento.
· Por otra parte, la persistencia
de estos líquidos en las zonas más bajas, que permanecen anegadas, produce la
contaminación de los suelos y de las napas de agua subsuperficiales,
tornándolas no aptas para higienización y consumo humano.
Otros riesgos:
· Si las zonas afectadas poseen
suelos inestables, de naturaleza erosionable o potencialmente colapsable, la
presencia constante de estos líquidos puede generar hundimientos en el terreno,
e incluso amenazar estructuras al descalzar fundaciones y afectar estética y
estructuralmente viviendas y otras construcciones humanas.
· Asimismo, las calles de tierra o
consolidadas y particularmente los pavimentos, se deterioran muy rápidamente
por la acción combinada de la presencia frecuente o permanente de líquido y el
tránsito vehicular intenso.
· Por sus características, estas
aguas además de ser riesgosas para la salud, tienen olor y aspecto
desagradable. Esto genera rechazo y una mala imagen, por lo que las zonas
afectadas tienden a ser evitadas por los mismos pobladores y los turistas,
desencadenando así impactos negativos indirectos en la valorización de las
propiedades y en la actividad económica a escala zonal.
· Finalmente, debe considerarse que
todo lo antes mencionado tiene un Impacto económico, ya que genera mayores
costos para mitigar o remediar los impactos negativos ambientales, sanitarios,
edilicios, comerciales y turísticos (Navarro, 2006).
Objetivos
La presencia de Escherichia coli es indicadora de
contaminación fecal reciente, dado que suele morir en no más de 24 hs. fuera
del intestino. Este es un dato que fue fundamental para llevar a cabo nuestro
objetivo el cual consistió
en:
Lograr, mediante
análisis microbiológicos, la identificación de organismos patógenos producto de
contaminación fecal que puedan ocasionar enfermedades en los seres vivos que
rodean a la laguna y que además sean indicadoras de aportes de nutrientes que
incrementen el proceso de eutrofización de la laguna.
Hipótesis
De
acuerdo al medio encontrado en
Materiales y
Métodos
Los métodos utilizados fueron los
siguientes:
Primero se realizó una toma de
muestras del medio de crecimiento de las bacterias, midiendo la temperatura y
el pH como parámetros principales.
Los puntos de muestreo fueron:
Nº 1:
Nº 2:
Sur de la laguna, en la desembocadura del desagüe de la calle Wenceslao
Paunero.
Nº 3:
Sur de la laguna,
Nº 4:
Oeste de la laguna,
Nº 5:
Noroeste de la laguna,
Nº 6:
Norte de la laguna, al terminar el embarcadero de botes,
Se recogió el agua en frascos
estériles de vidrio o plástico químicamente resistentes. No se precisó
conservantes especiales al momento de almacenar la muestra.
Posteriormente se realizó una
representación del medio de cultivos: selectivo, diferenciado, común, con el
fin de identificar distintos tipos de microorganismos, y luego un
acondicionamiento del medio de cultivo para lograr la proliferación; todo
utilizando la técnica de asépticas de cultivo.
Técnica aséptica de cultivo:
§
Se
utilizó, en lo posible, ropa blanca que protegiera la totalidad del cuerpo,
bien sea; bata o chaquetilla.
§
En
el caso de presentar cabello largo se utilizó cofia.
§
En
todo momento se procuró el empleo de barbijos, para evitar la propia
contaminación de la muestra.
§
Se
empleó gafas en caso de ser necesario
(esterilización de los medios de cultivo).
§
Se
trabajó bajo la técnica aséptica: manteniendo encendido siempre un mechero en
las cercanías del lugar de trabajo para esterilizar la zona de trabajo en un
diámetro de
§
Se
rotularon las soluciones en todo momento con nombre.
§
Todas
las superficies de trabajo fueron esterilizadas antes de comenzar la actividad mediante el empleo de una solución de Alcohol
70%.
§
En
todo momento se esterilizaron materiales, superficies, antes y después de
trabajar, etc., con solución alcohol 70%.
§
Una
vez preparados lo cultivos, y luego se su análisis, estos fueron inactivados,
sumergiendo el medio de cultivo en una solución con formol.
§
Los
recipientes que contuvieron el medio de cultivo, debieron lavarse y
esterilizarse con la solución de alcohol al 70% y en estufa a 120º C antes de
ser empleados nuevamente.
Una vez conseguido este objetivo
se realizó extracción de colonias una vez identificado el microorganismo. Se
aplicaron técnicas de tinción de acuerdo con las características del
microorganismo (método de tinción de Gram) y se realizó la observación
microscópica de los mismos para su identificación total, mediante el protocolo
de identificación.
Requerimientos para la tinción:
1. Solución violeta: solución
acuosa de cristal violeta 5g/l. Esta solución
es estable a temperatura ambiente.
2. Solución concentrada de Lugol:
La solución esta constituida por yodo, 50g/l, y yoduro de potasio 100g/l. El
recipiente debe mantenerse bien cerrado. Es estable a temperatura ambiente.
3. Solución decolorante: Etanol o
alcohol etílico, el envase debe mantenerse bien cerrado. Es estable a
temperatura ambiente.
4. Solución de Safranina:
Solución acuosa de Safranina, conteniendo 12.8g/l, solución estable a
temperatura ambiente.
Procedimiento:
Se realizó el extendido sobre un
portaobjetos limpio y desengrasado. La fijación se realizó pasando sobre la
llama del mechero, tres o cuatro veces, la superficie del portaobjetos
opuesta a la que contiene el extendido,
evitando el sobrecalentamiento (60 º C).
El portaobjetos, se colocó sobre una
fuente, con dos varillas de vidrio alineadas paralelamente como soporte del
portaobjetos.
1. Se
cubrió el preparado, previamente fijado, con la solución violeta, durante 1
minuto.
2. Se
lavó con agua.
3. Se
cubrió el porta con la solución de Lugol (diluida) durante
4. Se
lavó con solución decolorante (etanol) durante 5 segundos.
5. Nuevamente
se lavó con agua.
6. Se
cubrió con la solución de Safranina durante
7. Se
lavó con agua y secó.
Posteriormente se procedió al análisis
de los microorganismos identificados realizando medios de cultivo para el análisis
de coliformes totales y fecales.
Las bacterias coliformes son
aquellas bacterias de morfología bacilar. Gram (-), aerobias o anaerobias
facultativas, oxidasa negativas, no esporógenas, que fermentan la lactosa con
producción de ácido y gas a 37 º C en un tiempo máximo de 48 hs.
Este grupo comprende los géneros Escherichia, Citrobacter, Kebsiella y Enterobacter, pertenecientes a la
familia Enterobacteriáceas.
Interferencias:
Para evitar la contaminación por
microorganismo aéreos se esterilizó el material en autoclave (elementos que
vayan a entrar en contacto con el medio) a 121 º C durante 20 minutos.
Una vez concluida la
identificación y análisis de todos los microorganismos presentes en las
muestras, que incluía el conteo de unidades formadoras de colonias proliferadas
en cada placa de petri, se elaboraron las conclusiones correspondientes para
realizar a posterior un dictamen de resolución de problemas a las condiciones
que favorecen la proliferación de bacterias patógenas y se elaborarán posibles
soluciones para que no suceda.
Resultados
Las tablas muestran
los resultados obtenidos para los seis puntos de monitoreo para las muestras
tomadas el 7/11/08.
Tabla I. Medio de cultivo: Agar Levine
(lectura realizada a las 36 hs.).
COLIFORMES
TOTALES (1 ml.)
|
FECHA |
Punto 1 |
Punto 2 |
Punto 3 |
Punto 4 |
Punto 5 |
Punto 6 |
|
7/11/08 |
54 ufc/ml |
78 ufc/ml |
215 ufc/ml |
100 ufc/ml |
224 ufc/ml |
450 ufc/ml |
Tabla II. Medio de cultivo: Agar Levine.
(Lectura realizada a las 24 hs).
Escherichia coli (1
ml.)
|
FECHA |
Punto 1 |
Punto 2 |
Punto 3 |
Punto 4 |
Punto 5 |
Punto 6 |
|
12/11/08 |
10 ufc/ml. |
3 ufc/ml |
8 ufc/ml |
6 ufc/ml |
11 ufc/ml |
+100 ufc/ml |
Tabla III. Medio de cultivo: Chapman (manitol
- sal) (Lectura realizada a las 36 hs.)
Staphylococcus
|
FECHA |
Punto 1 |
Punto 2 |
Punto 3 |
Punto 4 |
Punto 5 |
Punto 6 |
|
07/11/08 |
68 ufc/ml |
76 ufc/ml |
106 ufc/ml |
172 ufc/ml |
170 ufc/ml |
0 ufc/ml |
Tabla IV. Medio de cultivo: Sabouraud
HONGOS
(MOHOS-LEVADURAS)
|
FECHA |
Punto 1 |
Punto 2 |
Punto 3 |
Punto 4 |
Punto 5 |
Punto 6 |
|
7/11/08 |
78 ufc/ml |
82 ufc/ml |
42 ufc/ml |
28 ufc/ml |
6 ufc/ml |
12 ufc/ml |
Conclusión:
Según
los parámetros de
Para Escherichia coli, el más alto valor
obtenido fue de + 100 ufc por mililitro de agua, cuando no deberían registrarse
más de
Bibliografía
Dirección Provincial de Agua y
Saneamiento (DiPAS). Decreto
415/99. Desarrollo
sostenible 2006.
http://www.dsostenible.com.ar/leyes/anexdec415cord.html
http://www.dsostenible.com.ar/leyes/dec415cord.html
Di Tofino, Exequiel. 2008.
Jóvenes hacia el futuro (apunte de prácticos de Química). Instituto Nuestra
Señora del Sagrado Corazón. Córdoba, Argentina.
Navarro, Joaquín. 2006. Riesgos en la salud y el ambiente derivados
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http://www.oocities.org/ar/foroambientalcba/cloacas.html
Subsecretaria
de Recursos Hídricos de
Traductor Google. 2008
http://www.translate.google.com/translate_t?hl=es