วิธีมาตรฐานสำหรับการวิเคราะห์ (Standard Operating Procedure)

Biochemical Oxygen Demand (BOD)

โดยวิธี 5 Days Incubation และ Azide Modification

ปริมาณของออกซิเจนที่แบคทีเรียใช้ในการย่อยสลายสารอินทรีย์ในน้ำภายใต้สภาวะที่มีอากาศ(Biochemical Oxygen Demand (BOD) คือ ค่าบีโอดีบ่งบอกถึงปริมาณความสกปรกของน้ำในรูปของปริมาณออกซิเจนที่ต้องการ เมื่อน้ำนั้นถูกปล่อยลงสู่แหล่งน้ำธรรมชาติ การหาค่า BOD₅ จะเป็นการหาออกซิเจนที่แบคทีเรียใช้ไปภายใต้การควบคุมอุณหภูมิที่ 20 ^oC เป็นเวลา 5 วัน

1. ขอบข่ายการทดสอบ

วิธีนี้ใช้ได้กับการทดสอบตัวอย่างน้ำเสียจากชุมชนและน้ำเสียจากโรงงานอุตสาหกรรม โดยถ้าจำเป็นจักต้องมีการทำ (seeding) และ (pretreatment)ที่เหมาะสม

2. ค่าที่รายงานผล(detection limits)

Minimum detection limit เท่ากับ 2 mg/l

3. รายละเอียดการประกันคุณภาพ(quality assurance criteria)

3.1 QA limit ของ “%ผลต่าง(relative percent difference)” สำหรับ การวิเคราะห์ซ้ำ(duplicate analysis) เท่ากับ 15%

3.2 ค่า BOD ของตัวอย่าง QC (Glucose-Glutamic acid) ควรมีค่า 198 ± 30.5 mg/l

3.3 ผลต่างของปริมาณ DO₀ และ DO₅ ต้องมีค่าอย่างน้อย 2 mg/l

3.4 ปริมาณ DO₅ ต้องมีค่าอย่างน้อย 1 mg/l

3.5 ผลต่างของปริมาณ DO₀ และ DO₅ สำหรับ Blank ของน้ำเจือจางต้องมีค่าไม่มากกว่า 0.2 mg/l สำหรับกรณีที่เติมน้ำเชื้อ ความแตกต่างของ DO สำหรับ Blank ควรจะอยู่ระหว่าง 0.6 และ 1.0 mg/l

4. หลักการวิธีทดสอบ

5. การเก็บรักษาตัวอย่าง

6. ข้อควรระวัง

7. เครื่องมือและอุปกรณ์

7.1 ขวด BOD ขนาด 250-300 ml พร้อมจุกปิดสนิทแบบ ground joint ส่วนใหญ่ใช้ขวดที่ทำพิเศษเพื่อการหาออกซิเจนละลายน้ำโดยเฉพาะ

7.2 ตู้ควบคุมอุณหภูมิ หรือ Water bath ซึ่งควบคุมอุณหภูมิได้ที่ 20 ± 1 ^oC และต้องมืดเพื่อป้องกันการสังเคราะห์แสงของสาหร่ายในตัวอย่าง

7.3 อุปกรณ์สำหรับเติมอากาศในน้ำ

7.4 ปิเป็ต(pipets)

7.5 กระบอกตวง(cylinder)

7.6 อุปกรณ์สำหรับการไตรเตรต (titrate)

7.7 ขวดวัดปริมาตร(volumetric flasks)

8. สารเคมี

8.1 สารละลาย Phosphate Buffer

นำสาร KH₂PO₄ มา 8.5 g สาร K₂HPO₄ มา 21.75 g สาร Na₂HPO₄.7H₂O มา 33.4 g และสาร NH₄Cl มา 1.7 g ละลายสารทั้งหมดในน้ำกลั่นประมาณ 500 ml แล้วเติมน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 1 l ค่า pH ของสารละลายนี้ควรจะประมาณ 7.2 โดยไม่ต้องปรับ

8.2 สารละลาย Magnesium Sulfate

8.3 สารละลาย Calcium Chloride

นำสาร CaCl₂ มา 27.5 g ละลายในน้ำกลั่น แล้วเติมน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 1 l

8.4 สารละลาย Ferric Chloride

นำสาร FeCl₃ . 6H₂O มา 0.25 g ละลายในน้ำกลั่น แล้วเติมน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 1 l

8.5 สารละลายกรดและด่าง 1 N เพื่อใช้ในการปรับค่า pH ของตัวอย่างให้เป็นกลาง

นำสาร Na₂SO₃ มา 1.575 g ละลายในน้ำกลั่น 1000 ml สารละลายนี้ไม่อยู่ตัว ต้อง เตรียมในวันที่จะใช้

8.7 สารป้องกันการเกิด Nitrification : 2chloro-6-(trichoromethyl) pyridine

8.8 สารละลาย Glucose-Glutamic acid

อบ Glucose (reagent grade) และ Glutamic acid (reagent grade) ที่อุณหภูมิ 103 ^oC เป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วนำ Glucose มา 150 mg และ Glutamic acid มา 150 mg ละลายในน้ำกลั่น แล้วเติมน้ำกลั่น จนได้ปริมาตร 1 l สารละลายนี้เก็บไว้ในตู้เย็นได้ 3 สัปดาห์

8.9 สารละลาย Manganous sulfate (DO#1)

นำสาร MnSO₄.4H₂O มา 480 g หรือสาร MnSO₄.2H₂O มา 400 g หรือสารMnSO₄.H₂O มา 364 g ละลายในน้ำกลั่น กรอง แล้วเติมน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 1 l สารละลายที่เตรียมได้ไม่ควรให้สีกับน้ำแป้ง เมื่อนำไปเติมลงไปในสารละลาย Potassium iodide (KI) ที่มีสภาพเป็นกรด

8.10 สารละลาย Alkali-Iodide-Azide (DO#2)

นำสาร NaOH มา 500 g (หรือสาร KOH 700 g) และสาร NaI มา 135 g (หรือสาร KI 150 g) ละลายในน้ำกลั่น แล้วเติมน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 1 l หลังจากนั้นนำสาร NaN₃ มา 10 g ละลายในน้ำกลั่น 40 ml แล้วนำไปเติมในสารละลายที่เตรียมขึ้น

8.11 กรด H₂SO₄ เข้มข้น (DO#3)

8.12 น้ำแป้ง

ละลาย Soluble Starch 2 g และ Salicylic acid 0.2 g ลงในน้ำกลั่นปริมาตร 100 ml ที่ทำให้ร้อน

ละลาย KH(IO₃)₂ 812.4 mg ในน้ำกลั่น แล้วทำให้เจือจางเป็น 1 l

8.14 สารละลายมาตรฐาน Sodium thiosulfate (0.025 N)

นำสาร Na₂S₂O₃.5H₂O มา 6.205 g ละลายในน้ำกลั่น แล้วเติม NaOH 6N จำนวน 1.5 ml หรือสาร NaOH จำนวน 0.4 g แล้วเติมน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 1 l ให้ทำการ Standardize สารละลายนี้ด้วยสารละลาย bi-iodate ที่ทราบความเข้มข้นแน่นอน

9. ขั้นตอนการวิเคราะห์

9.1 วิธีการหาโดยตรง

ในกรณีที่ตัวอย่างมีค่า BOD ไม่เกิน 7 mg/ส ไม่จำเป็นต้องเจือจางตัวอย่าง ส่วนใหญ่จะได้แก่น้ำจากแม่น้ำลำคลอง ให้วิเคราะห์ตัวอย่างตามขั้นตอนต่อไปนี้

9.1.5 นำขวดที่ 2 เข้าเก็บในตู้ควบคุมอุณหภูมิที่ 20 ^oC เป็นเวลา 5 วัน

9.1.6 หลังจาก 5 วัน วิเคราะห์หาปริมาณออกซิเจนที่ละลายน้ำที่เหลืออยู่ในขวดที่ 2

9.2 วิธีการที่ต้องเจือจางตัวอย่าง

วิธีนี้ใช้กับตัวอย่างที่มีความสกปรกสูง โดยมีค่าBOD มากกว่า 7 mg/l ซึ่งถ้าไม่เจือจางตัวอย่าง แบคทีเรียจะใช้ออกซิเจนจนหมดก่อนเวลา 5 วัน ทำให้ปริมาณออกซิเจนที่ละลายน้ำมีค่าเท่ากับศูนย์ จึงไม่สามารถหาค่าBODได้

2) เติมสารละลาย Phosphate Buffer, Magnesium Sulfate, Calcium Chloride และ Ferric Chloride อย่างละ 1 ml ต่อ น้ำกลั่น 1l

5) เติมน้ำเชื้อ (seed) ถ้าจำเป็น โดยปกติแล้วถ้าเป็นน้ำเชื้อจากน้ำเสียชุมชนจะใช้น้ำเชื้อ 2 ml ต่อน้ำเจือจาง 1 L

9.2.2. การเติมน้ำเชื้อ (seeding)

ตัวอย่างจำเป็นต้องมีจุลินทรีย์ ที่สามารถย่อยสลายสารอินทรีย์ได้ในปริมาณที่เพียงพอ น้ำเสียชุมชน น้ำที่ผ่านการบำบัดแบบชีวภาพและยังไม่มีการฆ่าเชื้อหรือเติมคลอรีน และน้ำผิวดินจะมีปริมาณของจุลินทรีย์ที่เพียงพอ แต่ตัวอย่างบางประเภทมีปริมาณจุลินทรีย์ไม่เพียงพอ เช่น น้ำเสียจากโรงงานบางประเภท น้ำเสียที่ผ่านการฆ่าเชื้อ น้ำเสียที่มีอุณหภูมิสูงหรือน้ำเสียที่มีความเป็นกรดหรือด่างสูง เป็นต้น สำหรับน้ำเสียประเภทเหล่านี้จำเป็นต้องเติมน้ำเชื้อลงในน้ำเจือจางด้วย น้ำเชื้อที่ใช้สามารถใช้น้ำเสียชุมชน โดยนำมาตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องอย่างน้อย 1 ชั่วโมง แต่อย่าให้นานเกิน 36 ชั่วโมง แล้วนำส่วนที่ใสมาใช้เป็นน้ำเชื้อ

การควบคุมน้ำเชื้อ(seed control) คือการวิเคราะห์ค่าBODของน้ำเชื้อที่ใช้เติมลงในน้ำเจือจาง ค่าที่ได้จะนำไปใช้คำนวณภายหลัง

9.2.3. การจัดการขั้นต้นกับตัวอย่าง

1) ตัวอย่างที่มีความเป็นกรดหรือด่างให้ปรับให้เป็นกลางโดยมีค่า pH อยู่ระหว่าง 6.5 ถึง 7.5 ด้วย H₂SO₄ หรือ NaOH โดยปริมาณของกรดหรือด่างที่เติมไม่ควรมากกว่า 5% ของปริมาตรตัวอย่าง

2) ตัวอย่างที่มีสารประกอบคลอรีนตกค้าง : ถ้าเป็นไปได้ควรหลีกเลี่ยงตัวอย่างที่มีสารคลอรีนตกค้าง โดยเก็บตัวอย่างก่อนที่จะผ่านเข้าขบวนการฆ่าเชื้อด้วยคลอรีน ถ้าตัวอย่างผ่านการฆ่าเชื้อด้วยคลอรีนแล้วตรวจไม่พบสารคลอรีนตกค้างให้เติมน้ำเชื้อในน้ำเจือจางด้วย ถ้าพบปริมาณคลอรีนตกค้างให้กำจัดคลอรีนก่อนและเติมน้ำเชื้อในน้ำเจือจางด้วย

3) ตัวอย่างที่มีสารพิษ : น้ำเสียจากโรงงานอุตสาหกรรมบางประเภท เช่น โรงงานชุบโลหะ จะมีโลหะที่เป็นสารพิษอยู่ ตัวอย่างประเภทนี้จำเป็นต้องได้รับการศึกษาและบำบัดเป็นกรณีพิเศษ

4) ตัวอย่างที่มีปริมาณออกซิเจนละลายน้ำเกินจุดอิ่มตัว : ตัวอย่างที่มีค่าออกซิเจนละลายน้ำมากกว่า 9 mg/L ที่อุณหภูมิ 20 ^oC ให้ลดปริมาณออกซิเจนลงมาจนถึงจุดอิ่มตัว โดยการเติมตัวอย่างไม่ต้องเต็มขวดแล้วเขย่า หรือ โดยการเติมอากาศ

5) การป้องกันการเกิด nitrification : ถ้าต้องการป้องกันความผิดพลาดของค่าBODจากการเกิด nitrification ให้เติม 2-chloro-6- (trichloro methyl) pyridine (TCMP) จำนวน 3 mg ในขวดBOD ขนาด 300 ml ก่อนปิดจุกหรือเติมในน้ำเจือจาง ให้มีความเข้มข้นสุดท้าย เท่ากับ 10 mg/l

9.2.4. การทำ Blank

นำน้ำเจือจางมาเทใส่ขวดBOD 6 ขวด นำ 3 ขวดไปวิเคราะห์หา DO ทันที และ 3 ขวดที่เหลือไปเก็บไว้ในตู้ควบคุมอุณหภูมิที่ 20 ^oC เป็นเวลา 5 วัน แล้วนำไปหา DO

9.2.5. การทำตัวอย่าง QC

1) เลือกตัวอย่างน้ำเสียชุมชนมา 1 ตัวอย่างใช้เป็นน้ำเชื้อ(seed) โดยนำมา 10 ml ใส่ลงไปในกระบอกตวง 1000 ml

2) เติม สารละลาย Glucose-Glutamic acid จำนวน 20 ml

3) เติมน้ำเจือจางจนได้ปริมาตร 1000 ml

4) กวนสารละลายในกระบอกตวงให้เข้ากันด้วยแท่งกวน

5) ค่อยๆ เทสารละลายในกระบอกตวงใส่ขวดBOD 3 ขวด พยายามอย่าให้มีฟองอากาศ

6) ขวด 1 นำไปหา DO ทันที

7) ขวด 2 และ 3 นำไปเก็บในตู้ควบคุมอุณหภูมิที่20^oCเป็นเวลา5วันแล้วจึงนำไปหา DO

9.2.6. การทำ Duplicate

ให้ทำ Duplicate สำหรับตัวอย่างน้ำที่ใช้ทำ QC โดยเจือจางตัวอย่างให้ได้ 1000 ml แล้วเทใส่ขวดBOD 3 ขวดนำไปหา DO ทันที 1 ขวด แล้วนำ 2 ขวดที่เหลือไปเก็บในตู้ควบคุมอุณหภูมิที่ 20 ^oC เป็นเวลา 5 วัน แล้วจึงนำไปหาค่า DO

การเจือจางตัวอย่างสามารถทำได้ 2 วิธี คือ การเจือจางในกระบอกตวง และการเจือจางโดยตรงในขวดBOD สำหรับการเจือจางโดยตรงในขวดBOD ถ้าใช้ตัวอย่างน้อยกว่า 0.5 ml ให้เจือจางตัวอย่างเบื้องต้นก่อน

2) กำหนดปริมาณการเจือจางตัวอย่าง โดยส่วนใหญ่กำหนด 3 ช่วง ให้ครอบคลุมค่าBODที่ประเมินไว้ การเจือจางที่ดีควรให้ผลของ DO ที่เวลา 5 วัน มีค่าอย่างน้อย 1 mg/l และปริมาณของ DO ที่ลดลงหลังจากเวลา 5 วัน ควรมีค่าอย่างน้อย 2 mg/l การหาค่า CODของตัวอย่าง ซึ่งสามารถรู้ผลภายในเวลา ประมาณ 2 ชั่วโมง สามารถช่วยในการเลือกช่วงที่จะเจือจางตัวอย่างได้ โดยส่วนใหญ่ค่า BOD จะมีประมาณ 60% ของค่าCOD หรืออาจจะประเมินจากประเภทของตัวอย่าง ดังนี้

น้ำเสียจากโรงงานอุตสาหกรรม ให้เจือจาง น้อยกว่า 1.0%

น้ำเสียชุมชน ให้เจือจาง 1 ถึง 5%

น้ำที่ผ่านการบำบัดทางชีวภาพ ให้เจือจาง 5 ถึง 25%

น้ำแม่น้ำที่เน่าเสีย ให้เจือจาง 25 ถึง 100%

*ข้อมูลจาก : Chemistry for Environmental Engineering, Sawyer and McCarty, 3^rded., p.424

สำหรับการเลือกช่วงเจือจางนั้น ให้ประมาณค่าBODของตัวอย่างก่อน เช่น ประมาณว่าตัวอย่างมีค่าBODเท่ากับ 500 mg/l จากตารางแนะนำให้เจือจางตัวอย่าง 1% สำหรับBODที่มีค่าอยู่ระหว่าง 200 ถึง 700 mg/l จากนั้นให้เลือกเจือจางตัวอย่างอีก 2 ช่วง ที่มากกว่าและน้อยกว่า 1% อยู่ 1 ขั้น คือ 0.5% และ 2.0% ช่วงของBODที่ทำการเจือจางจะเป็น 100 ถึง 1400 mg/l ซึ่งน่าจะครอบคลุมค่าBODของตัวอย่างและสามารถป้องกันการผิดพลาดที่อาจเกิดขึ้นจากการประมาณขั้นต้น

7) ค่อยๆ เทตัวอย่างลงในขวดBOD จำนวน 2 ขวด พยายามอย่างให้เกิดฟองอากาศ เพราะจะถือว่า DO ของตัวอย่างทั้ง 2 ขวด มีค่าเท่ากัน ปิดจุกหล่อน้ำ ใส่ฝาครอบ

8) นำตัวอย่างไปเก็บไว้ในตู้ควบคุมอุณหภูมิที่ 20 ^oC 1 ขวด ขวดที่เหลือนำไปวิเคราะห์หาค่า DO ทันที ด้วยวิธี Azide Modification

ในกรณีที่หาค่า DO โดยใช้วิธี Membrane Electrode ให้เตรียมตัวอย่างขวดเดียว และหาค่า DO เริ่มต้นก่อน แล้วจึงปิดฝาอย่าให้มีฟองอากาศในขวด หล่อน้ำ แล้วนำไปเก็บในตู้ควบคุมอุณหภูมิ

การหาค่า DO สามารถทำได้ 2 วิธี คือวิธี Winkler (azide modification) และ วิธี Membrane Electrode

ขั้นตอนการหา DO โดยวิธี Winkler (azide modification)
1) เทน้ำที่หล่อจุกขวดตัวอย่างออก
2) เปิดจุก เติมสารละลาย Manganese sulfate (DO#1) 1 ml โดยขณะเติมให้ปลายปิเป็ต(pipet) อยู่ใต้ผิวน้ำ
3) เติมสารละลาย Alkali-Iodide-Azide (DO#2) 1 ml โดยให้ปลาย ปิเป็ต(pipet) อยู่ใต้ผิวน้ำขณะเติม
4) ปิดจุกโดยอย่าให้มีฟองอากาศภายในขวด คว่ำขวดไปมาหลาย ๆ ครั้งเพื่อให้สารผสมกัน
5) ตั้งทิ้งไว้ให้ตกตะกอนจนได้ปริมาณน้ำใส เกินครั้งหนึ่งของขวด
6) เติมกรด H2SO4 เข้มข้น(DO#3) 1 ml โดยให้กรดค่อย ๆ ไหลลงไปข้าง ๆ คอขวด ปิดจุกคว่ำขวดขึ้นลงหลายครั้งจนกระทั่งตะกอนละลายหมด
7) ตวงปริมาตร 201 ml นำไป ไตรเตรต(titrate) กับสารละลายมาตรฐาน sodium thiosulfate (0.025 N) จนได้สีเหลืองอ่อน
8) เติมน้ำแป้ง 2-3 หยดจะได้สีน้ำเงินเข้มทำการไตรเตรตต่อไปจนกระทั้งสีน้ำเงนหายไปปริมาตรของสารละลายมาตรฐาน Sodium thiosulfate ที่ใช้จะเทียบเท่ากับปริมาณของออกชิเจน(DO)ของน้ำตัวอย่างโดยมีหน่วยเป็น mg/l

10. การคำนวณ

10.1 กรณีไม่มีการเติมน้ำเชื้อในน้ำเจือจาง

BOD = DO₀ – DO₅

โดยที่ BOD₅ = ค่า BOD ที่ระยะเวลากักเก็บตัวอย่าง 5 วันมีหน่วยเป็น mg/l

10.2 กรณีเติมน้ำเชื้อในน้ำเจือจาง

B₁ = DO ของ seed control ก่อนนำเข้าตู้ควบคุมอุณหภูมิ, mg/l

B₂ = DO ของ seed control หลังจากเก็บไว้ 5 วัน

f = อัตราส่วนน้ำเชื้อในตัวอย่างที่เจือจางกับใน seed control

11. การรายงานผล

รายงานผลค่า BOD เป็นเลขจำนวนเต็มมีหน่วยเป็น mg/l

12. เอกสารอ้างอิง

วิธีการทดสอบนี้ยึดหลัก (followed) วิธีที่ 5210 B ของ Standard Method for the Examination of Water and Wastewater, 18^th edition, 1992. APHA, AWWA, WEF.