วิธีมาตรฐานสำหรับการวิเคราะห์ (Standard Operating Procedure)
Total Phosphorus
โดยวิธี Persulfate digestion และ Ascorbic acid
ฟอสฟอรัส(phosphorus)ในน้ำธรรมชาติและในน้ำเสียส่วนใหญ่อยู่ในรูปต่างๆกันของ ฟอสฟอรัส(phosphate) ซึ่งสามารถแยกได้เป็น ออร์โธฟอสเฟส (orthophosphates) คอนเดนซ์ฟอสเฟส (condensed phosphates,pyro-, meta-,and polyphosphates อื่นๆ) และ Organically Bound Phosphates โดยอยู่ในรูปของสารละลาย สารแขวนลอยหรือในร่างกายของสิ่งมีชีวิตในน้ำ Phosphorousเป็นธาตุที่จำเป็นในการเจริญเติบโตของพืชและสัตว์ และมักจะพบว่าเป็น Growth Limiting Nutrient ของแหล่งน้ำ ดังนั้นในการปล่อยน้ำโสโครกที่มี Phosphorousอยู่ลงในแหล่งน้ำ อาจจะกระตุ้นให้เกิดการเจริญเติบโตของพืชน้ำอย่างรวดเร็วอันก่อให้เกิดปัญหาอื่น ๆ ตามมา
1. ขอบข่ายการทดสอบ
วิธีการทดสอบนี้ใช้กับตัวอย่างน้ำเสียจากชุมชนและอุตสาหกรรม
2. ค่าที่รายงานผล(detection limits)
Minimum Detection Limit เท่ากับ 0.1 mg P/l
3. รายละเอียดการประกันคุณภาพ(quality assurance criteria)
3.1 QA Limit สำหรับ Spike Recovery เท่ากับ 20%
3.2 QA Limit สำหรับการวิเคราะห์ซ้ำ เท่ากับ 15%
4. หลักการ
การวิเคราะห์หาฟอสฟอรัสทั้งหมด แบ่งเป็น 2 ขั้นตอน คือ
4.1. เปลี่ยนฟอสฟอรัสในรูปต่างๆให้อยู่ในรูป Orthophosphates ที่ละลายน้ำโดยการย่อยสลาย ด้วยวิธี Persulfate Digestion
4.2.หาค่า Orthophosphates ที่ละลายน้ำด้วยวิธี Ascorbic Acid โดย Ammonium Molybdate และ Potassium Antimonyl Tartrate จะทำปฏิกริยาภายใต้ตัวกลางที่เป็นกรดกับ Orthophosphate ทำให้เกิด Phosphomolydic Acid ซึ่งจะทำปฏิกริยากับ Ascorbic Acid ได้ Molybdenum Blue
5. การเก็บรักษาตัวอย่าง
ในกรณีที่จะทำการหา Total Phosphorus อย่างเดียวสามารถเก็บรักษาตัวอย่างได้ 3 วิธีคือ
5.1. ให้แช่แข็งตัวอย่างโดยไม่ต้องเติมสารใด ๆ หรือ
5.2 เติม กรด HCl เข้มข้นในปริมาณ 1 ml ต่อตัวอย่าง 1 l แล้วแช่เย็น หรือ
5.3 เติมกรด H2SO4 เข้มข้นในปริมาณ 2 ml ต่อตัวอย่าง 1 l แล้วแช่เย็น
โดยให้วิเคราะห์ตัวอย่างภายใน 28 วัน ตัวอย่างที่มีค่าฟอสฟอรัสน้อยไม่ควรเก็บในขวดพลาสติกเพราะอาจเกิดการดูดซับบนผนังขวดได้ ภาชนะที่ทำด้วยแก้วทุกชนิดที่ใช้ในการหาฟอสฟอรัส ต้องล้างด้วยกรด HCl 1:1แล้วล้างด้วยน้ำกลั่นหลาย ๆ ครั้งไม่ควรใช้ผงซักฟอกในการล้างเครื่องแก้ว
6. สิ่งรบกวน
6.1 Arsenates สามารถทำปฏิกริยากับสารละลาย Molybdate ทำให้เกิดสีน้ำเงิน เช่นเดียวกับ Phosphate ความเข้มข้น 0.1 mg As/l จะรบกวนการหา Phosphate
6.2 Hexavalent Chromium และ NO-2 ที่ความเข้มข้น 1 mg/l จะรบกวนให้ค่าที่ได้ต่ำไป 3% และที่ความเข้มข้น 1.0 - 10 mg/l จะทำให้ค่าต่ำไป 10 -15%
7. เครื่องมือและอุปกรณ์
7.1. Spectrophotometerที่สามารถให้ความถี่คลื่น880nmและใช้เซล ขนาด1cmหรือใหญ่กว่านั้น
7.2. หม้ออบฆ่าเชื่อ(autoclave )
7.3. ขวดวัดปริมาตร(volumetric flask)
7.4. บีคเกอร์(beakers)
7.5. ปิเป็ต(Pipets)
7.6. กระบอกตวง(cylinder)
7.7. ขวดแก้วพร้อมฝาที่สามารถนำเข้าเครื่อง Autoclave ที่ 120 oC ขนาด 100 ml
8. สารเคมี
8.1.สารละลายมาตรฐาน Phosphate (20 mg P/l)
นำ anhydrous KH2PO4 มา 87.8 mg ละลายในน้ำกลั่นให้ได้ 1,000 ml (1 ml ของสารละลายที่เตรียมนี้มีความเข้มข้นเท่ากับ 0.02 mg P)
8.2. สารละลาย Phenolphthalein Indicator
ละลาย Phenolphthalein 5 gใน 500 ml ของ 95% Ethyl alcohol และปรับปริมาตรให้ได้ 1,000 ml ด้วยน้ำกลั่น
8.3. สารละลาย H2SO4
เติม H2SO4 เข้มข้น จำนวน 300 ml ลงในน้ำกลั่น 600 ml แล้วปรับปริมาตรให้ได้ 1,000 ml ด้วยน้ำกลั่น
8.4. สาร Potassium Persulfate (K2S2O8)
8.5. NaOH 1N
ละลาย NaOH จำนวน 40 gในน้ำกลั่น แล้วปรับปริมาตรเป็น 1,000 ml ด้วยน้ำกลั่น
8.6 H2SO4 5 N
นำกรด H2SO4 เข้มข้น มา 70 ml ใส่ในน้ำกลั่นแล้วปรับปริมาตรให้ได้ 500 ml
8.7. สารละลาย Potassium Antimonyl Tartrate
ละลายสาร K(SbO) C4H4O7. 1/2 H2O จำนวน 1.3715 g ในน้ำกลั่น 400 ml แล้วเติมน้ำกลั่นให้ได้ 500 ml เก็บในขวดจุกแก้ว
8.8. สารละลาย Ammonium Molybdate
ละลายสาร (NH4)6 Mo7O24.4H2O จำนวน 20 g ลงในน้ำกลั่นปริมาตร 500 ml เก็บในขวดจุกแก้ว
8.9. สารละลาย Ascorbic Acid 0.1 M
ละลายสาร Ascorbic Acid จำนวน 1.76 g ในน้ำกลั่นปริมาตร 100 ml สารละลายนี้เมื่อเก็บไว้ ที่อุณหภูมิ 4oC สามารถเก็บได้ 1 สัปดาห์
8.10. สารละลายผสม
ผสมสารละลายข้อ 6-9 ตามอัตราส่วนดังนี้
สารข้อ 6 : สารข้อ 7 : สารข้อ 8 : สารข้อ 9
50 : 5 : 15 : 30
จะได้สารละลายผสม 100 ml
ในการผสมนั้นให้ผสมทีละขั้นตอน โดยผสมสารข้อ 6 และ7 ให้เข้ากันดีก่อนแล้วจึงเติมสารข้อ 8 เขย่าให้เข้ากันแล้วจึงใส่สารข้อ 9 ผสมให้เข้ากัน และเมื่อสารมีอุณหภูมิเท่าอุณหภูมิห้อง เก็บสารนี้ไว้ได้นาน 4 ชั่วโมง
9. ขั้นตอนการวิเคราะห์
9.1. การทำ Standard curve
นำสารละลายมาตรฐาน phosphate (20 mgP/l) มา 0, 1, 2, 3, 4, 5 ml ผสมน้ำกลั่นให้ได้ 50 ml จะได้สารละลายฟอสฟอรัสมาตรฐานที่มีความเข้มข้น 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, และ 2 mg/l ตามลำดับ นำไปวิเคราะห์เหมือนตัวอย่างทุกขั้นตอน (กรณีที่มี Standard Curve อยู่แล้ว ให้เตรียมสารละลายมาตรฐานที่อย่างน้อย 2 ความเข้มข้น แล้วนำไปวิเคราะห์เหมือนตัวอย่างทุกขั้นตอน และตรวจสอบความถูกต้อง โดยค่า % Difference ต้องน้อยกว่า 15%)
9.2. การทำ QC
เลือกตัวอย่างอย่างน้อย 1 ตัวอย่าง ต่อตัวอย่างทุกๆ 10 ตัวอย่าง สำหรับการวิเคราะห์ซ้ำและ Spike Recovery โดยมีขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง(สำหรับ 1 ตัวอย่าง)ดังนี้
9.2.1. นำ Volumetric Flask ขนาด 50 ml มา 3 ขวด
9.2.2. ใส่ ตัวอย่างที่เลือกไว้สำหรับทำการวิเคราะห์ซ้ำและ Spike Recovery จำนวน 10 ml ในแต่ละ Flask
9.2.3. นำ 2 Flask ที่ใส่ตัวอย่างแล้ว มาเติมสารละลายมาตรฐาน Phosphate (20 mg P/l) flask ละ 1 ml
9.2.4. เติมน้ำกลั่นในทั้ง 3 Flask จนได้ปริมาตรรวมในแต่ละ Flask 50 ml
9.2.5. นำไปวิเคราะห์เช่นเดียวกับตัวอย่างอื่น
9.3. การวิเคราะห์ตัวอย่าง
การเปลี่ยนฟอสฟอรัสให้อยู่ในรูปของ Orthophosphate โดยวิธี Presulfate Digestion
9.3.1. นำตัวอย่างมา 50 ml หรือน้อยกว่าแล้วเติมน้ำกลั่นให้ได้ 50 ml ใส่ในขวดขนาดบรรจุ 100 ml
9.3.2. เติมสารละลาย Phenolphthalin Indicator 1 หยด ถ้าตัวอย่างเปลี่ยนเป็นสีแดงให้เติมสาร ละลาย H2SO4 ลงไปจนสีแดงหายไป
9.3.3. เติมสารละลาย H2SO4 จำนวน 1 ml
9.3.4. เติมสาร K2S2O8 จำนวน 0.5 g ปิดฝาให้สนิท
9.3.5. นำตัวอย่างไปเข้าเครื่อง Autoclave ที่อุณหภูมิ 120 oC เวลา 30 นาที
9.3.6. ทำให้เย็นแล้วเติม Phenolphthalein Indicator 1 หยด และปรับ pH ด้วย NaOH 1N จนได้ตัวอย่างสีชมพูอ่อน
9.3.7. ถ่ายตัวอย่างใส่ใน Volumetric Flask ขนาด 100 ml แล้วปรับปริมาตรด้วยน้ำกลั่นให้ได้ 100 ml
9.3.8. นำตัวอย่างไปวิเคราะห์ด้วยวิธี Ascorbic Acid Method
การหาค่า Orthophosphate โดยวิธี Ascorbic Acid
9.3.9. นำตัวอย่างมา 50 ml เติม phenolphthalein indicator 1 หยด ถ้าตัวอย่างเปลี่ยนเป็นสีแดง ให้เติม H2SO4 5 N ทีละหยดจนสีหายไป
9.3.10. เติมสารละลายผสม ปริมาณ 8 ml ลงในตัวอย่างปรับปริมาตรให้เป็น 50 ml เขย่าให้เข้ากันดี หลังจากนั้น 10 นาที แต่ไม่เกิน 30 นาที ให้นำตัวอย่างไปวัดค่า absorbance ที่ 880 nm
10. การคำนวณ
Total Phosphorous, mg P/l = (ความเข้มข้นของฟอสฟอรัสที่ได้จาก Standard curve, mg P/l) x 50
ปริมาตรของตัวอย่างที่ใช้, ml